دانستنیهاعلمی پژوهشی

رنگ آمیزی هیستوشیمی

۱- میلوپراکسیداز:

میلوپراکسیداز آنزیمی است که در گرانولهای اولیه نوتروفیلها، ائوزینوفیلها و تا حدی در منوسیتها یافت می شود. لنفوسیتها فعالیت میلوپراکسیداز از خود نشان نمی دهند. این رنگ آمیزی برای افتراق AML از ALL بسیار مفید است. میلوپراکسیداز در حضور پراکسید هیدروژن، سوبسترای رنگ را اکسید می کند و رنگ سیاه تا قرمز- قهوه ای در محل فعالیت تولید می کند. بنزیدین سوبسترای غالب مورد استفاده در این رنگ آمیزی بود اما بدلیل کارسینوژنیک بودن کنار گذاشته شد. سوبوستراهای دیگر مانند    دی آمینو بنزیدیدن و پارافنیلن دی آمین دی هیدروکلراید و کاتکول اخیرا مورد استفاده قرار گرفته و بی ضررند. همانطور که گفته شد میلوپراکسیداز در گرانولهای اولیه سلولهای میلوئید وجود دارد و از مرحله پرومیلوسیتها شروع می شود. میلوبلاستهای لوکمیک نیز معمولاً مثبت هستند. در لوسمی های حاد، AML-M1 (عدم بلوغ) ، AML-M2 (با بلوغ) و AML-M3 (پرومیلوسیتیک) بیش از ۸۰% بلاستها فعالیت میلوپراکسیدازی از خود نشان می دهند. بدلیل اینکه این واکنش بسیار قوی است بسیاری از Auer rods که با رنگ آمیزی رایت- گیمسا دیده نمی شوند در این رنگ آمیزی قابل روئیت هستند. منوسیتها دارای واکنش منفی یا مثبت ضعیف هستند (بصورت منتشر) و لنفوبلاستها و لنفوسیتها میلوپراکسیداز منفی می باشند. در بیماران ALL کمتر از ۳% از بلاستها فعالیت میلوپراکسیدازی از خود نشان می دهند. باید توجه داشت که گرانولوسیتهای بالغ نیز دارای فعالیت این آنزیم می باشند و فاقد اهمیت تشخیصی هستند.

رنگ آمیزی میلوپراکسیداز که واکنش مثبت را در گرانولهای اولیه سلولها را نشان می دهد. به Auer rode توجه کنید که با فلش مشخص شده است. مغز استخوان ۱۰۰۰x

۲- رنگ آمیزی سودان بلاک B:

تکنیک رنگ آمیزی دیگری است که برای افتراق AML از ALL مفید است. الگوی رنگ آمیزی شباهت زیادی به میلو پراکسیداز دارد و احتمالاً برای سلولهای میلویدی اولیه حساسیت بیشتری دارد. سودان بلاکB  بدیل حلالیت در ذرات چربی، لیپیدها را رنگ آمیزی می کند نظیر استرولها، چربی های خنثی و فسفولیپیدها. این چربی ها در گرانولهای اولیه و ثانویه نوتروفیلها و گرانولهای لیزوزومال منوسیتها یافت می شوند. گرانولوسیتها (نوتروفیلها) از مرحله میلوبلاست تا مراحل بلوغ، سودان بلاک B مثبت هستند. با افزایش بلوغ بدلیل افزایش گرانولهای اولیه و ثانویه، میزان رنگ پذیری تشدید می شود. منوسیتها از منفی تا مثبت ضعیف متغیر هستند و فعالیت منتشری را نشان می دهند. سلولهاس لنفوئیدی نیز معمولاً منفی هستند با این وجود در ALL کمتر از ۳% سلولهای بلاست نتایج مثبت را نشان می دهند.

رنگ آمیزی سودان بلاک B : در این تصویر شدت رنگ پذیری سلولها با افزایش بلوغ تشدید یافته است کمترین میزان رنگ پذیری در میلوبلاست و بتدریج با تولید گرانولهای اولیه و ثانویه در میلوسیتها، متامیلوسیتها، باند و سلول بالغ، افزایش یافته است

۳- رنگ آمیزی استراز:

واکنش استراز برای تمایز سلولهای میلوئید از سلولهای با منشاء منوسیتی. برای انجام این رنگ آمیزی سوبسترای متفاوتی مورد استفاده قرار می گیرد نظیر نفتول AS-D کلرواستات (اختصاصی)، آلفا نفتیل استات یا آلفا نفتیل بوتیرات (غیر اختصاصی) استرازها استرها را هیدرولیز می کنند و یک ترکیب نفتیل رها شده و با یک نمک دیازونیوم ترکیب می شود که یک رنگ روشن در ناحیه فعالیت آنزیم تولید می کند. استرازها می توانند برای تمایز لوسمی های حاد میلوئیدی (M1, M2, M3) از لوسمی های منوسیتیک (M5) مورد استفاده قرار گیرند. هنگامی که نفتول AS-D کلرواستات بعنوان سوبسترا مورد استفاده قرار می گیرد واکنش مثبت در سلولهای میلوئیدی و واکنش منفی تا واکنش ضعیف در سلولهای منوسیتی مشاهده می شود. کلرواستات استراز در گرانولهای اولیه نوتروفیلها وجود دارد. میلوبلاستهای لوکمیک معمولاً مثبت هستند. Auer rods  نیز بخوبی واکنش مثبت نشان می دهند. آلفا نفتیل استات استراز واکنش مثبت قوی در منوسیتهایی که با افزودن فلوراید سدیم مهار شده اند، تولید می کنند. سلولهای میلوئیدی و لنفوئیدی معمولاً منفی هستند. واکنش آلفا نفتیل بوتیرات در منوسیتها مثبت است، این ماده حساسیت کمتری از آلفا نفتیل استات دارد اما اختصاصی تر است و سلولهای میلوئیدی و لنفوئیدی معمولاً واکنش منفی دارند. AML-M4 باید در هر دو رنگ آمیزی با نفتول AS-D کلرواستات استراز و آلفا نفتیل بوتیرات استراز یا آلفا نفتیل اسستات استراز مثبت باشد زیرا که در این لوسمی هر دو رده میلوئیدی و منوسیتی حضور دارند.

واکنش نفتول AS-D کلرواستات استراز درترکیب با آلفا نفتیل بوتیرات استراز در اسلاید لوسمی میلومنوسیتیک مزمن که منوسیتها به رنگ قهوه ای و نوترویلها به رنگ آبی مشاهده می شوند.

واکنش مثبت نفتول AS-D کلرواستات استراز در دو سلول میلوئیدی (مغز استخوان x 1000)

۴- پریودیک اسید شیف (PAS): رنگ امیزی PAS ممکن است در تشخیص برخی از لوسمی های لنفوئیدی حاد و AML-M6 مفید باشد. سلولها دارای مقادیر مختلف گلیکوژن هستند و پریودیک اسید با اکسید کردن گلیکوژن، موکوپروتئینها و سایر کربوهیدراتهای با وزن مولکولی سنگین آنها را به آلدئید تبدیل می کند. این آلدئیدها با معرف بی رنگ شیف واکنش داده و آنها را به رنگ صورتی- قرمز رنگ آمیزی می کنند. شدت رنگ آمیزی به تعداد گروههای آلدئیدی آزاد شده توسط پریودیک اسید وابسته است. الگوی رنگ آمیزی PAS ممکن است ظریف و منتشر، خشن و گرانولار(Block) یا ترکیبی از هردو باشد. گرانولوسیتها PAS مثبت هستند و شدت رنگ آمیزی با افزایش بلوغ سلولها، افزایش می یابد، مگاکاریوسیتها رنگ پذیری ظریف و منتشر از خود نشان می دهند، هرچند پلاکتها در این رنگ آمیزی بشدت رنگ صورتی- قرمز را می پذیرند اما پیشسازهای طبیعی اریتروسیتها رنگ نمی گیرند. در ALL سلولها الگوی رنگ پذیری متفاوتی را نشان می دهند. لنفوبلاستها در ALL ممکن است ظریف و منتشر، خشن و گرانولار(Block) یا ترکیبی از هردو را نشان دهند. لنفوبلاستها در ALL همچنین ممکن است در رنگ آمیزی PAS منفی باشند بویژه برای زیرگروه L3 (لنفوم بورکیت). در زیرگروه M6 لوسمیهای میلوئیدی حاد اریتروبلاستهای PAS مثبت ممکن است یافت شوند. مثبت بودن ممکن است دارای الگوی گرانولار و خشن باشد بویژه در اریتروبلاستهای اولیه یا الگوی مثبت منتشره که بسیار معمول هستند در اریتروبلاستهای ثانویه دیده می شوند. پیشسازهای اریتروئیدی در مغز استخوان طبیعی فعالیت PAS از خود نشان نمی دهند.

واکنش PAS مثبت با الگوی خشن در یک بیمار مبتلا به ALL

واکنش PAS مثبت با الگوی خشن در اطراف هسته پیشسازهای اولیه اریتروئیدی در یک بیمار مبتلا به AML-M6

۵- آنتی بادی های فاکتور VIII:

موارد تشخیص لوسمی حاد مگاکاریوبلاستیک (M7) نیازمند رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی هستند. آنتی بادی های منوکلونال یا پلی کلونال ضد فاکتور ۸ وابسته به آنتی ژن نتایج مثبتی در لوسمی مگاکاریوبلاستیک از خود نشان می دهند.

رنگ آمیزی فاکتور VIII مثبت در یک بیمار مبتلا به لوسمی مگاکاریوسیتیک حاد (M7) – بیوپسی مغز استخوان x1000

۶- آلکالین فسفاتاز لکوسیتی :

فعالیت آنزیمی آلکالین فسفاتاز لکوسیتی (LAP) برای تمایز لوسمی میلوئیدی مزمن از واکنش لوکموئید که ممکن است در عفونتهای شدید دیده شود، مفید است. آلکالین فسفاتاز لکوسیتی در گرانولهای ثانویه نوتروفیلها یافت می شود. در این رنگ آمیزی سوبسترای نفتول AS-BI فسفات توسط این آنزیم در PH قلیایی هیدرولیز می شود. این سوبسترای هیدرولیز شده در ترکیب با یک رنگ نظیر fast red-violet LB یا fast blue BB رسوب رنگی در ناحیه فعالیت آنزیم تولید می کند. فعالیت آلکالین فسفاتاز لکوسیتی فقط در پلی مورفونوکلئرهای بالغ و سلولهای باند امتیاز دهی می شوند. دامنه امتیازات فعالیت آنزیم از ۰ تا ۴+ می باشد. امتیازات ۱۰۰ سلول PMN بالغ و باند برای امتیاز آلکالین فسفاتاز لکوسیتی جمع می شوند، بعنوان مثال:

بدلیل هدفمند بودن امتیازدهی توصیه می شود که دو اسلاید برای هر بیمار و توسط دو نفر امتیاز دهی شود. این امتیازات نباید بیش از ۱۰% با یکدیگر اختلاف داشته باشند. دراین صورت اسلاید سومی از بیمار باید تهیه شده و مجدداً امتیازدهی شود. ائوزینوفیلها فعالیت آلکالین فسفاتاز از خود نشان نمی دهند و نباید با نوتروفیلهای بالغ با امتیاز صفر اشتباه شوند. یک امتیازدهی نرمال برای فعالیت LAP باید بین ۱۰۰-۲۰ باشد اما بدلیل هدفمند بودن امتیازدهی بسیار مهم است که هر آزمایشگاهی مقادیر نرمال خود را تهیه نماید.

امتیاز فعالیت LAP در افراد مبتلا به CML درمان نشده کاهش دارد درحالی که در واکنش لوکموئید دامنه امتیاز LAP از بالای نرمال تا مقادیر بالاتر می باشد. شرایط دیگری که امتیاز دهی فعالیت LAP را افزایش می دهند شامل سه ماهه سوم بارداری و پلی سایتمی ورا می باشند. امتیاز در موارد پلی سایتمی ثانویه طبیعی است. شرایطی که سبب کاهش امتیاز فعالیت LAP می شود شامل هموگلوبینوری حمله ای شبانه(PNH) ، آنمی سیدروبلاستیک و ناهنجاری های میلودیس پلاستیک هستند. خلاصه تفسیر امتیازدهی برای فعالیت LAP در جدول زیر مشاهده می شود.

واکنش آلکالین فسفاتاز لکوسیتی در نوتروفیلها از ۰ در شکل A تا ۴+ در شکل E. اسمیر خون محیطی x1000

۷- اسید فسفاتاز (مقاوم به تارتارات):

تقریباً تمام سلولهای خونی حاوی هفت ایزو آنزیم غیر اریتروئیدی اسید فسفاتاز هستند که عبارتند از: ۰, ۱, ۲, ۳, ۳b, 4 و ۵٫ سلولهای موییHairy cells) ) ایزو آنزیم ۵ را به فراوانی تولید می کنند. به همین دلیل این ویژگی، رنگ آمیزی اسید فسفاتاز را ابزار تاییدی و تشخیصی مفیدی برای لوسمی مویی شکل می سازد. اسید فسفاتاز سوبسترای نفتول AS-BI فسفریک اسید را هیدرولیز می کند که با جفت شدن با رنگ fast garnet GBC جفت شده و رسوب قرمزرنگی را در ناحیه فعالیت آنزیم تولید می کند. هنگامی که L(+) – تارتاریک اسید اضافه می شود تمام ایزو آنزیمها بجز ایزو آنزیم ۵ مهار می شوند. ایزو آنزیم ۵ به تارتاریک اسید مقاوم است. اصطلاح رنگ آمیزی TRAP (اسید فسفاتاز مقاوم به تارتارات) اغلب برای نشان دادن این پدیده مورد استفاده قرار می گیرد.

اغلب سلولهای خونساز فعالیت اسیدفسفاتازی از خود نشان می دهند. گرانولوسیتها، لنفوسیتها و منوسیتها همگی واکنش مثبت را در مقادیری ازواحد افزوده L(+) – تارتاریک اسید نشان می دهند اما بدلیل عدم وجود ایزو آنزیم ۵ در این سلولها فعالیت آنزیم مهار می شود، این درحالی است که سلولهای مویی که حاوی ایزوآنزیم ۵ هستند با افزودن تارتارات مثبت باقی می مانند، حداقل دو سلول یا بیشتر حاوی ۴۰ گرانول قرمز رنگ یا بیشتر هستند.

واکنش اسید فسفاتاز مثبت. اگر سلولهای مویی وجود داشته باشند رنگ آمیزی پس از افزودن تارتاریک اسید مثبت باقی خواهد ماند (اسمیر خون محیطی در فرد مبتلا به Hairy Cell Leukemia) X1000